Điện di gel agarose (điện di ngang) – Những vấn đề cần quan tâm

1. Điện di gel agarose (điện di ngang) là gì?
2. Nguyên lý của điện di gel agarose (điện di ngang)
3. Phân tích kết quả điện di ngang
4. Một số ứng dụng của điện di ngang
5. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả điện di ngang
6. Lựa chọn loại agarose và nồng độ agarose trong điện di ngang

Điện di gel agarose (điện di ngang) là gì?

Kỹ thuật điện di gel agarose (điện di ngang) thường được sử dụng trong sinh học phân tử (SHPT) để phân tách DNA dựa trên kích thước. Kỹ thuật này cũng được sử dụng để phân tách RNA hoặc protein.

Nguyên lý của điện di gel agarose (điện di ngang)

Để phân tách DNA bằng phương pháp điện di gel agarose, người ta sẽ nạp DNA vào các giếng trên miếng gel và áp một dòng điện lên miếng gel (Hình 1). Vì khung sườn phosphate của DNA (và RNA) tích điện âm , khi được đặt trong điện trường thì DNA sẽ di chuyển về phía điện cực dương (anode).

Bởi vì DNA có tỷ lệ khối lượng/điện tích (mass/charge) đồng nhất, nên khi điện di thì DNA chỉ phân tách theo kích thước. Các đoạn DNA kích thước càng lớn thì khoảng cách di chuyển càng ngắn (Hình 2).

Xem thêm về quy trình điện di gel agarose TẠI ĐÂY.

Phân tích kết quả điện di ngang

Vì DNA là “vô hình” trong mắt con người, chúng cần được “nhuộm” để có thể quan sát. Một số thuốc nhuộm gel (staining dye) phổ biến là SYBR Gold, SYBR Green, Gelstar, GelRed, … Các thuốc nhuộm huỳnh quang này cho phép quan sát vạch DNA (band) dưới ánh sáng UV hoặc xanh lam.

Để phân tích kích thước DNA, mẻ chạy điện di luôn đi kèm một thang DNA (ladder). Thang DNA là tập hợp các đoạn DNA đã biết trước kích thước. Loại thang DNA sử dụng cần phải phù hợp với kích thước của DNA mục tiêu cần phân tích (Hình 2).

Một số ứng dụng của điện di ngang

Ngoài việc phân tách DNA, RNA, protein … theo kích thước để phát hiện và phân tích. Điện di gel agarose còn cho phép thu hồi sản phẩm điện di để thực hiện các thí nghiệm phía sau.

1. Tạo dòng (cloning): Điện di gel agarose được sử dụng để tinh sạch DNA sau khi xử lý enzyme cắt giới hạn (RE) hoặc sản phẩm PCR cho mục đích tạo dòng (cloning).
2. Lai phân tử (blotting): Điện di gel agarose là bước đầu tiên của quy trình phân tích Southern Blot cho DNA và Northern Blot cho RNA.
3. Chẩn đoán (diagnostic): Điện di gel agarose cho phép phát hiện sản phẩm PCR, vạch DNA đặc hiệu cho tác nhân gây bệnh (vi khuẩn, virus, nấm, …).
4. Dấu ấn di truyền (genetic fingerprinting): Điện di gel agarose cho phép phân tích sản phẩm PCR hoặc RFLP, giúp xác định dấu ấn di truyền của người, động vật, thực vật, vi sinh vật, …

Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả điện di ngang

1. Cấu trúc DNA (conformation)
2. Loại agarose và nồng độ agarose
3. Loại thang DNA (ladder)
4. Đệm điện di (running buffer)
5. Hiệu điện thế (voltage)
6. Đệm nạp mẫu (loading buffer)
7. Phương pháp nhuộm gel (staining)

Xem thêm ảnh hưởng cụ thể của từng yếu tố TẠI ĐÂY.

Lựa chọn loại agarose và nồng độ agarose trong điện di ngang

Có thể phân nhóm các loại agarose trên thị trường thành 4 loại (Hình 4):

1. Standard Agarose
2. Standard, High Gel Strength Agarose
3. Low Melting Temperature Agarose
4. Low Viscosity, Low Melting Temperature Agarose

Standard Agarose cho phép phân tách DNA kích thước 100bp đến 25kb, tuỳ vào nồng độ agarose sử dụng (0.5 – 2%). Hạn chế: nhiệt độ nóng chảy cao (85 – 95°C)

Standard, High Gel Strength Agarose cho phép đổ gel ở nồng độ agarose rất thấp (xuống đến 0.3%) để phân tích DNA kích thước lớn (lên đến 60kb).

Low Melting Temperature Agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (~65°C) cho phép thu hồi DNA mạch đôi. Một số loại agarose nhóm này có nhiệt độ tạo gel thấp (8 – 15°C) nên sau khi đã nấu chảy thì sẽ không tạo gel khi để nguội, nhờ đó có thể đưa tế bào vào một cách an toàn (ví dụ: biến nạp vi khuẩn).

Low Viscosity, Low Melting Temperature Agarose đã được biến đổi về mặt hoá học, cho phép khả năng phân tách xuống đến 4bp, gần tương đương với điện di gel poly-acrylamide (PAGE).

Bởi vì chất lượng agarose giữa các hãng có thể sẽ rất khác nhau, người dùng cần đọc kỹ thông tin sản phẩm để hiểu về đặc điểm agarose đang sử dụng.

Tài liệu tham khảo

Armstrong, J.A. and Schulz, J.R., 2015. Agarose gel electrophoresis. Current Protocols Essential Laboratory Techniques, 10(1), pp.7-2.

Biegeleisen, K., 2017. Methods for Non-Destructively Separating or Reannealing the Strands of Circular Duplex DNA Chromosomes. Open Access Library Journal, 4(2), pp.1-31.

Green, M.R. and Sambrook, J., 2019. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols, 2019(1), pp.pdb-top100388.

Lee, P.Y., Costumbrado, J., Hsu, C.Y. and Kim, Y.H., 2012. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (62), p.e3923.

Magdeldin, S. ed., 2012. Gel electrophoresis: Principles and basics. BoD–Books on Demand.