Điện di gel agarose (điện di ngang) – Các yếu tố ảnh hưởng kết quả

• Xem thêm Điện di gel agarose – Những vấn đề cần quan tâm
• Xem thêm Điện di gel agarose – Hiểu quy trình trong 5 phút

Trong thực tế, kết quả điện di có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố. Bài viết này sẽ cung cấp kiến thức về các yếu tố ảnh hưởng kết quả điện di, từ đó giúp bạn tự tin hơn thiết lập thí nghiệm điện di gel agarose:

1. Cấu trúc DNA (conformation)
2. Loại agarose và nồng độ agarose
3. Loại thang DNA (ladder)
4. Đệm điện di (running buffer)
5. Hiệu điện thế (voltage)
6. Đệm nạp mẫu (loading buffer)
7. Phương pháp nhuộm gel (staining)

Cấu trúc DNA (conformation)

Cấu trúc DNA có ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ điện di trên gel agarose (Hình 1). Dưới đây là một số vấn đề cần lưu ý khi điện di DNA trên gel agarose:

1. DNA mạch thẳng (linear) hay mạch vòng (circular)?
2. DNA mạch vòng giãn xoắn (nicked) hay vòng siêu xoắn (superhelical)?
3. DNA mạch đôi (dsDNA) hay DNA mạch đơn (ssDNA)?

Chưa có thông tin cụ thể rằng trong điều kiện nào thì cấu trúc DNA nào sẽ điện di nhanh hơn. Vì vậy cách tốt nhất là điện di kèm mẫu chứng có cấu trúc DNA tương ứng để đối chiếu.

Loại agarose và nồng độ agarse

Có thể phân nhóm các loại agarose trên thị trường thành 4 loại (Hình 2). Mỗi loại agarose sẽ phù hợp các kích thước DNA khác nhau, cũng như ứng dụng khác nhau.

1. Standard Agarose
2. Standard, High Gel Strength Agarose
3. Low Melting Temperature Agarose
4. Low Viscosity, Low Melting Temperature Agarose

Loại thang DNA (ladder)

Thang DNA (ladder) là 1 hỗn hợp các đoạn DNA có kích thước đã biết trước. Thang DNA thường được gọi tên theo kích thước nhỏ nhất có thể phân tích, ví dụ: 50bp, 100bp, 1kb, … (Hình 3).

Tuy nhiên, vạch kích thước cụ thể của thang DNA phụ thuộc rất nhiều vào hãng sản xuất. Việc lựa chọn thang DNA phù hợp sẽ giúp việc phân tích thành phần DNA trong mẫu trở nên chính xác và dễ dàng.

Đệm điện di (running buffer)

Dung dịch đệm điện di (running buffer) đóng vai trò rất quan trọng trong điện di phân tách DNA. Đệm điện di không chỉ cung cấp pH mà còn cung cấp ion để dẫn điện. Nếu lỡ nhầm buffer thành nước thì DNA sẽ không di chuyển khi điện di. Nếu lỡ nhầm buffer quá đậm đặc thì nhiệt độ tạo ra có thể khiến gel agarose bị nóng chảy.

Các đệm điện di phổ biến trong điện di gel agarose:

1. TAE (Tris-acetate-EDTA)
2. TBE (Tris-borate-EDTA)

TAE (Tris-acetate-EDTA) có khả năng đệm thấp nhất trong 3 loại buffer. Do đó, TAE dễ bị cạn kiệt khi điện di thời gian dài nên cần thay buffer định kỳ. Tuy nhiên, TAE phân tách tốt DNA kích thước lớn và là lựa chọn tốt khi muốn thu hồi DNA sau khi điện di.

TBE (Tris-borate-EDTA) phân tách tốt DNA kích thước nhỏ (<1kb). Tuy nhiên, TBE không phù hợp để thu hồi DNA sau khi điện di. Hơn nữa, TBE cũng dễ bị tủa trong quá trình bảo quản.

Hiệu điện thế (voltage)

Khi điện di, hiệu điện thế càng cao thì DNA sẽ di chuyển nhanh hơn. Tuy nhiên nếu hiệu điện thế quá cao thì các đoạn DNA lớn (≥12-15kb) sẽ tạo vệt mờ (smear/streak). Ngược lại, khi hiệu điện thế quá thấp thì các đoạn DNA nhỏ (≤1kb) sẽ bị giảm tốc độ, dẫn đến tạo vạch rộng do bị phân tán và khuếch tán. Vì vậy cần lựa chọn hiệu điện thế và loại buffer phù hợp (Hình 4).

Đệm nạp mẫu (loading buffer)

Đệm nạp mẫu (loading buffer) được thêm vào mẫu DNA trước khi nạp vào giếng điện di. Buffer này chứa glycerol giữ cho DNA chìm xuống giếng. Ngoài ra, nó cũng chứa thuốc nhuộm đánh dấu (tracking dye) để theo dõi tiến độ điện di.

Hai loại tracking dye được sử dụng phổ biến là bromophenol blue và xylene cyanol. Xylene cyanol thường di chuyển cùng với các đoạn DNA lớn (~5kb). Ngược lại, bromophenol blue thường di chuyển cùng với các đoạn DNA nhỏ (~0.5 kb). Cần hạn chế không để vạch DNA mục tiêu trùng vị trí của tracking dye.

Phương pháp nhuộm gel (staining)

Thuốc nhuộm (staining dye) là thành phần bắt buộc để có thể quan sát được kết quả điện di DNA. Hai phương pháp nhuộm gel phổ biến là nhuộm trước khi điện di và nhuộm sau khi điện di.

Trong phương pháp nhuộm trước khi điện di, thuốc nhuộm được cho trực tiếp vào agarose đang nóng chảy. Phương pháp này giúp quy trình điện di trở nên đơn giản hơn rất nhiều. Tuy nhiên, một số thuốc nhuộm như Ethidium Bromide (EtBr) tích điện dương sẽ ảnh hưởng kết quả điện di (Hình 5).

Tài liệu tham khảo

Armstrong, J.A. and Schulz, J.R., 2015. Agarose gel electrophoresis. Current Protocols Essential Laboratory Techniques, 10(1), pp.7-2.

Biegeleisen, K., 2017. Methods for Non-Destructively Separating or Reannealing the Strands of Circular Duplex DNA Chromosomes. Open Access Library Journal, 4(2), pp.1-31.

Green, M.R. and Sambrook, J., 2019. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols, 2019(1), pp.pdb-top100388.

Lee, P.Y., Costumbrado, J., Hsu, C.Y. and Kim, Y.H., 2012. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (62), p.e3923.

Magdeldin, S. ed., 2012. Gel electrophoresis: Principles and basics. BoD–Books on Demand.