Kỹ thuật PCR – Nguyên lý, ứng dụng và thuật ngữ trong PCR

• Xem thêm Kỹ thuật PCR – Một số kiểu PCR thường gặp

1. PCR là gì?
2. Nguyên lý hoạt động
3. Ứng dụng thực tế
4. Thuật ngữ thường gặp
5. Tóm tắt về PCR trong 3 phút

PCR là gì?

Polymerase Chain Reaction (PCR) là kỹ thuật cho phép nhanh chóng tạo ra hàng triệu – hàng tỷ bản sao của một đoạn DNA cụ thể. Vì vậy, kỹ thuật PCR được phân loại vào nhóm kỹ thuật khuếch đại DNA.

Nguyên lý hoạt động

Để khuếch đại DNA bằng PCR, các chu kỳ nhiệt được sử dụng để sao chép DNA. Cứ qua mỗi một chu kỳ (cycle) thì số lượng bản sao DNA sẽ nhân đôi. Như vậy, sau 20 – 30 chu kỳ thì một đoạn DNA cụ thể ban đầu sẽ được nhân bản thành hàng triệu bản sao (Hình 1).

Trong chu kỳ PCR, người ta sử dụng DNA polymerase để tổng hợp DNA mạch bổ sung cho DNA mạch khuôn. Do enzyme này chỉ có hoạt tính kéo dài, quá trình tổng hợp DNA cần một đoạn oligonucleotide ngắn để làm mồi (primer).

Một chu kỳ PCR gồm 3-bước (Hình 2)

1. Biến tính (denaturation)
   Sử dụng nhiệt độ cao 95°C để tách DNA mạch đôi (dsDNA) thành 2 sợi DNA mạch đơn (ssDNA).
2. Bắt cặp (annealing)
   Hạ nhiệt độ xuống thấp (55 – 70°C) để mồi (primer) bắt cặp với trình tự mục tiêu. Nhiệt độ bắt cặp mồi thường là (Tm – 5)°C. Trong đó Tm là nhiệt độ nóng chảy của mồi (primer).
3. Kéo dài (extension)
   DNA polymerase kéo dài đầu 3′ của mồi (primer) để tổng hợp mạch DNA mới theo chiều 5′ – 3′. Một loại polymerase phổ biến trong PCR là Taq DNA polymerase. Enzyme này hoạt động tối ưu ở 72°C.

Thực tế, Taq DNA polymerase sẽ có hoạt tính tăng dần theo nhiệt độ từ 30 – 72°C. Vì vậy, nếu đoạn DNA mục tiêu ngắn, bước kéo dài sẽ được nhập chung vào bước bắt cặp để tiết kiệm thời gian.

DNA là vô hình với con người, vì vậy để phân tích sản phẩm khuếch đại, người ta sử dụng kỹ thuật điện di. Có 3 kỹ thuật điện di phổ biến là điện di gel agarose, điện di SDS-PAGE, và điện di mao quản.

• Xem thêm về Kỹ thuật điện di gel agarose (điện di ngang)

Ứng dụng thực tế

Kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, bao gồm y tế, thực phẩm, nông nghiệp, thú y, thuỷ sản, môi trường, …

Một số ứng dụng thực tế (Hình 3)

• Phát hiện đột biến và chỉnh sửa DNA
• Xác định xu hướng di truyền của bệnh
• Chẩn đoán và điều trị nhiễm virus
• Xét nghiệm phát hiện mầm bệnh
• Nhận diện bệnh nhiễm mới nổi
• Phát hiện và phân tích vi sinh vật
• Thực hành pháp y, khoa học hình sự
• Phát hiện Ung thư và xác định mức độ bệnh
• Tạo dòng cDNA/DNA và giải trình tự nucleotide

Thuật ngữ thường gặp

DNA mạch khuôn (template) là DNA mạch đơn (ssDNA) chứa trình tự mục tiêu trong bước biến tính của chu kỳ nhiệt.

Mồi (primer) là ssDNA ngắn bắt cặp bổ sung với trình tự DNA mục tiêu, cung cấp đầu 3′-OH cho DNA polymerase để tổng hợp DNA mạch bổ sung.

DNA polymerase là một enzyme tổng hợp DNA. Loại DNA polymerase phổ biến nhất trong PCR là Taq DNA polymerase, có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermis aquaticus ở suối nước nóng.

Nucleotide (dNTP) gồm 4 loại A, T, G, C. Các dNTP chính là nguyên liệu để tổng hợp DNA mạch bổ sung.

Master Mix là thuật ngữ ám chỉ hỗn hợp phản ứng PCR, chưa bao gồm mẫu DNA.

Tóm tắt về PCR trong 3 phút

Tài liệu tham khảo

Ehtisham, M., Wani, F., Wani, I., Kaur, P. and Nissar, S., 2016. Polymerase chain reaction (PCR): back to basics. Indian Journal of Contemporary Dentistry, 4(2), p.30.

Singh, J., Birbian, N., Sinha, S. and Goswami, A., 2014. A critical review on PCR, its types and applications. Int. J. Adv. Res. Biol. Sci, 1(7), pp.65-80.

Xue, Y., Braslavsky, I. and Quake, S.R., 2021. Temperature effect on polymerase fidelity. Journal of Biological Chemistry, 297(5).